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迎接蛋白组学样品处理新挑战 Empore StageTips助力高通量检测

2022-04-15 [319]
 蛋白组学脱胎于人类基因组计划中的功能基因组学,是研究细胞、组织或完整生物体所拥有的全套蛋白质的学科,“全景式地研究在各种特定情况下的蛋白质谱。”(贺福初,中国蛋白质组计划,中国科学基金,2002264-268

蛋白组学的实验过程高度依赖优化的样品前处理。其中,蛋白消解和质谱分析这两步之间的处理过程对整体分析质量和灵敏度有着非常重要的影响。一种名为StageTips的关键技术于2003年由南丹麦大学蛋白质组学领域著名学者Matthias Mann报道,并因其高效和简便而在蛋白组学研究中得到广泛使用。许多研究机构根据自身课题特点开发了StageTips的应用规程。

StageTips是一种填充了Empore膜片的微量移液管。其全称是“Stop and go extraction tips”,喻意为蛋白分解产生的肽被Empore膜片拦截,然后由适当的溶剂释放出来。这个过程中,盐份去除,肽得到纯化和浓缩,或者预分馏。Empore膜片由高分子纤维网固定住的功能颗粒构成,同时具有很好的物理特性(如柔软、致密)和化学特性(如高保留因子),使StageTips特别适用于LC/MS分析之前处理肽溶液样品。膜片中功能颗粒种类的多样性使StageTips具有多种不同性能,可以根据应用内容有多种选择,并可以在一支StageTips中组合使用。

 

a - 单层Empore膜片的StageTips(放大图中为Empore膜片材料结构示意); b – 多层膜片的StageTips

 

 

1 StageTips外观

Empore相对于用松散颗粒制成的产品有多种优势,包括:颗粒填充致密无沟流;无需筛板;洗脱体积小;容量可由增加膜片层数而扩大。

 

 

2.  Empore StageTips 质量控制:这些数据显示SDB-RPS StageTips 在不同批次和同一批次内测试结果的良好可重复性和可靠性,证实生产工艺的优越性。

 

应用实例一:美国著名医院Mayo Clinic 2020 开发了基于StageTips和临床质谱的 疫情快速诊断方案,可以达到和PCR相似的精度。

 

 

3. Mayo Clinics疫情高通量检测方案:基于StageTips OrbiTrap LC-MS

 

应用实例二:高通量磷酸化蛋白质组学检测

DNA转录成mRNA要再翻译成具有特定氨基酸序列的蛋白质才能在体内发挥功能,其中大部分蛋白质往往还需要经过化学修饰才能具备真正的活性,这种修饰称为翻译后修饰(PTM)。翻译修饰的过程,就是在蛋白质氨基酸序列中添加特定氨基酸或改变特定化学官能团的过程,进而改变蛋白质的结构。已有实验证明有三百多种潜在的PTM类型,并且同一个蛋白质可能在多个位点发生修饰,这就促成了蛋白结构和功能上的多样性。在众多的PTM类型中,磷酸化修饰(Phosphorylation modification)的蛋白占到了所有蛋白质约三分之一,是普遍的修饰类型之一。会影响到细胞内信号转导、细胞结构、细胞增殖、凋亡、转录、代谢过程以及调控病原微生物的适应能力等等,所以在不同细胞中,蛋白磷酸化水平会呈现不同的差异,特定位点的磷酸化程度可能从小于1%到大于90%。

 

4. StageTips 用于高通量磷酸化蛋白质组学检测

磷酸化蛋白质组学是研究这个蛋白质磷酸化修饰的重要方法之一。如图四所示,通过采用基于StageTips的高通量蛋白质组学样品制备方法,相对于传统样品制备方法来说,所需要的检测样品少了10倍,检测时间减少3倍,但定量化磷酸化位点增加了3倍,极大了提高了研究效率。

高碱性条件下的分馏可大大提高蛋白质检出率。相比于传统的方法,比如离线HPLC 泵,或者散装填料装的TipsEmpore C18 Stage Tips 更为高效,同时成本更低。图五显示的数据表明通过StageTips 在高碱性条件下的分馏样品处理,蛋白质检出量增加了50%,同时蛋白质覆盖率提高了10%

 

图5: HeLa细胞系用 Empore C18 StageTips在高碱性条件下进行分馏处理可大大增加蛋白质和多肽的检出水平。

 

Empore还具有自身优势,其中可供选择的功能颗粒和应用如下表所示。

膜片

C18-silica

肽脱盐;酸性和中性条件下的肽分馏

C8-silica

大分子肽和蛋白质脱盐;作为松散颗粒填料的筛板

SDB-XC

碱性条件下的肽分馏

SDB-RPS

RP+SCX,兼具XCSCX功能

Anion exchange (SAX)

用盐和分步pH进行肽分馏

Cation exchange (SCX)

用盐和分步pH进行肽分馏

Chelating beads

用途待定

Activated carbon

用途待定

多层膜片

C18-SCX

脱盐用盐和分步pH进行肽分馏

C18-SCX-C18

脱盐用盐和分步pH进行肽分馏,然后再次脱盐

SDB-SAX

脱盐用盐和分步pH进行肽分馏

膜片与颗粒结合

金属氧化物-C8

磷肽富集

 

【附带说明:】Empore原本由3M公司生产。2019年,莱伯泰科公司从3M公司收购了Empore的生产线,由旗下CDS公司全面掌握生产工艺并生产和销售。许多将Empore作为关键材料的高科技产品得以继续生产。

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