在(-)-11-nor-9-羧基-△9-四氢大麻酚代谢物(THCCOOH)的气相色谱-质谱分析中,评估了EmporeTM固相萃取柱(4215SD-C18)的样品制备。固相萃取柱性能由测定的回收率决定。回收率范围在78.7-110.1%。标准曲线线性范围在0.15μg/mL~3.0μg/mL时,相关系数R2=0.9998。
关键词:
四氢大麻酚,THCCOOH,外标法,GC-MS
前言:
美国CDS公司膜式固相萃取 (SPE)技术,以其有机溶剂消耗少、结果重现性高、样品制备的通量高、提取物更清洁,可减少 GC 系统的污染以及自动化提取等优势[1],广泛应用于药物检测领域[2,3]。本实验使用美国CDS公司膜式固相萃取柱(EmporeTM,4215SD-C18)提取尿液中△9-四氢大麻酚(THC,大麻)代谢物(-)11-nor-9-羧基-△9-四氢大麻酚 (THCCOOH),并以GC-MS分析定量。
1, 实验过程
所有试剂均为分析纯或更高。
THCCOOH(100.0±0.6 μg/mL)和 MSTFA + 1% TMCS硅烷化试剂,均购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司;
人工尿液(PH:5.7-500mL),购自福州飞净生物科技有限公司;
乙酸乙酯(色谱纯),购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司;
甲醇(色谱纯),购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司;
正己烷(色谱纯),购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司;
EmporeTM 膜式固相萃取柱:4215SD-C18,购自美国CDS公司;
气质联用仪:7890B-5977B安捷伦气质联用仪,Agilent公司。
THCCOOH标准使用溶液:0.1 μg/mL,溶剂体系为甲醇;
1.3 实验部分
取12个15mL离心管,分别装入3mL尿液样品,再加入不同体积的THCCOOH标准使用液(加标量分别为3ng、15ng、30ng、60ng、150ng、300ng),每个标点进行平行两次制备。然后加入300μL氢氧化钾溶液(10mol/L),在60℃水浴环境下水解15min取出后冷却至室温,再以冰醋酸调节pH值到4.0~4.5。
EmporeTM固相萃取柱(C18, 7mm/3mL)预先用150μL甲醇进行活化,之后进行上样(在重力作用下使样品自然流下),上样结束后用750μL甲醇-水溶液(50:50)淋洗萃取柱,在690mmHg真空状态下干燥5min,最后用800μL正己烷-乙酸乙酯溶液(75:25)进行洗脱。
洗脱液经40℃氮吹至干,然后加入100μL衍生试剂(MSTFA+1%TMCS),在60℃水浴条件下衍生20min,转移至样品瓶待 GC-MS分析。
取6个20mL样品瓶,分别加入不同体积THCCOOH标准使用溶液,加入THCCOOH的质量分别为3ng、15ng、30ng、60ng、150ng、300ng,参照与加标样品制备同等浓缩、衍生条件进行前处理,待GC-MS分析。
进样口温度:290℃;进样模式:不分流进样;流速:1.0mL/min;
柱温:100℃保持1min,然后以30℃/min的速度升至300℃,保持5min。
表1 THCCOOH定量、定性离子
化合物 | 定量、定性离子 | 保留时间(min) |
THCCOOH | 371/473/488 | 12.158 |
2, 实验结果(外标法)
实验发现:标准曲线第一个点(3ng)信噪比较低,难以准确积分。标准曲线第五个点(150ng)结果明显偏低,为实验操作衍生化失误引进误差。
图1标准曲线校准点重叠色谱图
图2 标准曲线
3,结果与讨论
本次实验展示了一种使用CDS-EmporeTM 固相萃取柱(215SD-C18),对尿液中四氢大麻酚代谢物(THCCOOH)进行富集提取的简单有效方法。实验中,尿液加标样品经水解、固相萃取净化、浓缩以及衍生等前处理步骤后,经GC-MS分析得到不同浓度下四氢大麻酚代谢物(THCCOOH)的加标回收率,回收率范围在78.7-110.1%,结果较好。标准曲线浓度范围在0.15μg/mL~3.0μg/mL时,相关系数R2=0.9998,具有较好线性。实验表明,CDS-EmporeTM 固相萃取柱(215SD-C18)适用于尿液中四氢大麻酚代谢物(THCCOOH)的萃取净化。该方法具有操作简便,线性范围宽,稳定性高等优点,并在尿液量少,分析物浓度较低时显示出优异的回收率。
4,参考文献
1,Jasbir Singh and Linda Johnson,Solid-Phase Extraction of THC Metabolite from Urine using the Empore Disk Cartridge Prior to Analysis by GC-MS,Journal of Analytical Toxicology, Vol. 21, September 1997。
2,R.H. Liu and B.A. Goldberger. Handbook of Workplace Drug Testing. AACC Press, Washington, DC, 1995.
3, A.H.B. Wu, N. Liu, Y.-J. Cho, K.G. Johnson, and S.S. Wong. Extraction and simultaneous elution and derivatiztion of 11-nor-9- carboxy-△9-tetrahydrocannabinol using Toxi-Lab SPEC prior to GC/MS analysis of urine, J. Anal. Toxicol. 17:215-17 (1993)
图3 不同浓度加标样品重叠色谱图
表2 加标回收率结果
序号 | 加标量 | 回收率 % | 均值 % | |
ng | 1 | 2 | ||
1 | 15 | 82.2 | 96.4 | 89.3 |
2 | 30 | 101.8 | 109.4 | 105.6 |
3 | 60 | 89.2 | 78.7 | 83.9 |
4 | 150 | 93.1 | 101.3 | 97.2 |
5 | 300 | 91.4 | 110.1 | 100.7 |
注:因3ng标点信噪比偏低,在此不做数据统计